熒光和熒光壽命

分子包含多個單能態S0、S1、S2…和三重態T1…，每個能態都包含多個精細的能級。正常情況下，大部分電子處在較低能態即基態S0 的較低能級上，當分子被光束照射，會吸收光子能量，電子被激發到更高的能態S1 或S2 上，在S2 能態上的電子只能存在很短暫的時間，便會通過內轉換過程躍遷到S1 上，而S1 能態上的電子亦會在極短時間內躍遷到S1 的*低能級上，而這些電子會存在一段時間后通過震蕩弛豫輻射躍遷到基態，這個過程會釋放一個光子，即熒光。

此外，亦會有電子躍遷至三重態T1 上，再由T1 躍遷至基態，我們稱之為磷光。

熒光特性

研究熒光特性時，主要在以下幾方面進行分析：激發光譜，發射光譜、熒光強度、偏振熒光、熒光發光量子產率、熒光壽命等。其中熒光壽命（Fluorescence Lifetime）是指熒光分子在激發態上存在的平均時間（納秒量級）。

熒光壽命測試

熒光壽命一般在幾納秒至幾百納秒之間，如今主要有兩類測試方法：時域測量和頻域測量時間穩定性實驗測試曲線：

1 時域測量

由一束窄脈沖將熒光分子激發至較高能態S1，接著測量熒光的發射幾率隨時間的變化。其中目前廣泛應用的是時間相關單光子計數，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)

時間相關單光子計數(TCSPC) 實現了從百ps-ns-us 的瞬態測試，此方法對數據的獲取所有依賴快速探測器和高速電路。用統計的方法計算樣品受激后發出的一個( 也是僅有的一個) 光子與激發光之間的時間差，也就是下圖的START( 激發時刻) 與STOP( 發光時刻) 的時間差。由于對于Stop 信號的要求，所以TCSPC 一般需要高重復頻率的光源作為激發源，其重復至少要在100KHz 以上，多數的光源都會達到MHz 量級；同時，在一般情況下還要對Stop 信號做數量上的控制，做到盡量滿足在一個激發周期內，樣品產生且只產生一個光子的有效熒光信號，避免光子對的出現。

2 頻域測量

對連續激發光進行振幅調制后，分子發出的熒光強度也會受到振幅調制，兩個調制信號之間存在與熒光壽命相關的相位差，因此可以測量該相位差計算熒光壽命。

左圖為正弦調制激發光（綠色）頻域顯示，發射光信號（紅色）相應的相位變化頻域顯示。

右圖為對應不同壽命的調制和相位的頻域顯示。TM- 調制壽命，TP- 相位壽命。[1]

顯微熒光壽命成像技術（FLIM）

顯微熒光壽命成像技術（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，FLIM）是一種在顯微尺度下展現熒光壽命空間分布的技術，由于其不受樣品濃度影響，具有其他熒光成像技術無法代替的優異性能，目前在生物醫學工程、光電半導體材料等領域是一種重要的表征測量手段。

FLIM 一般分為寬場FLIM 和激光掃描FLIM。

寬場FLIM（Wide Field FLIM,WFM）

該技術是用平行光照明并由物鏡聚焦樣品獲得熒光信號，再由一寬場相機采集熒光成像。寬場FLIM 常用于快速獲取大面積樣品成像。時域或是頻域壽命采集都可以應用在寬場成像FLIM 上。寬場FLIM 有更高幀率和低損傷的優勢。

2 激光掃描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）

激光掃描FLIM 是針對選定區域內的樣品逐點獲取其熒光衰減曲線，再經過擬合最終合成熒光壽命圖像。相比寬場FLIM，其在空間分辨率、信噪比方面有更大的優勢。掃描方式有兩種：一種是固定樣品，移動激光進行掃描，一種是固定激光，電動位移臺帶動樣品移動進行掃描。

FLIM 應用

材料科學領域

• 寬禁帶半導體如GaN、SiC 等體系的少子壽命mapping 測量

• 量子點如CdSe@ZnS 等用作熒光壽命成像顯微鏡探針

• 鈣鈦礦電池/LED 薄膜的組分分析、缺陷檢測

• 銅銦鎵硒CIGS，銅鋅錫硫CZTS 薄膜太陽能電池的組分、缺陷檢測

• 鑭系上轉換納米顆粒

• GaAs 或GaAsP 量子阱的載流子擴散研究

生命科學領域

• 細胞體自身熒光壽命分析

• 自身熒光相對熒光標記的有效區分

• 活細胞內水介質的PH 值測量

• 局部氧氣濃度測量

• 具有相同頻譜性質的不同熒光標記的區分

• 活細胞內鈣濃度測量

• 時間分辨共振能量轉移（FRET）：納米級尺度上的遠差測量，環境敏感的FRET 探針定量測量

• 代謝成像：NAD(P)H 和FAD 胞質體的熒光壽命成像

OmniFluo-FLIM系列顯微熒光壽命成像系統應用案例

1 用熒光分子對海拉細胞進行染色

用熒光分子轉子Bodipy-C12 對海拉細胞（宮頸癌細胞的一種） 進行染色。

(a) 顯微熒光壽命成像圖，壽命范圍1ns（藍色）到2.5ns（紅色）；

(b) 熒光壽命直方圖，脂肪滴的短壽命約在1.6ns 附近，細胞中其他位置壽命較長，在1.8ns 附近。

用熒光分子轉子的時間分辨測量*大的好處在于熒光壽命具備足夠清晰的標簽特性，且與熒光團的濃度無關。[2]